人細胞凋亡酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)
試劑盒使用說明書
- 僅用于科研，不得用于臨床診斷！
- 用于定量檢測人血清、血漿及其他相關(guān)液體樣本中細胞凋亡的含量。
- 有效期：6個月。
- 保存條件：2-8℃
使用前請仔細閱讀說明書！
實驗原理：
本試劑盒應(yīng)用生物素雙抗體夾心法測定樣品中人細胞凋亡水平。向預(yù)先包被了人細胞凋亡單克隆抗體的酶標孔中加入細胞凋亡，溫育；溫育后，加入生物素標記的抗細胞凋亡抗體。再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的細胞凋亡呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人細胞凋亡的濃度。
試劑盒組成
試劑盒組成： | 48孔配置 | 96孔配置 |
說明書 | 1份 | 1份 |
封板膜 | 2片（48） | 2片（96） |
密封袋 | 1個 | 1個 |
酶標包被板 | 1×48 | 1×96 |
標準品：32ng/ml | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 |
標準品稀釋液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 |
鏈霉親和素-HRP | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
生物素標記的抗Apoptosis抗體 | 0.5ml×1瓶 | 1 ml×1瓶 |
顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
終止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 |
濃縮洗滌液 | （20ml×20倍）×1瓶 | （20ml×30倍）×1瓶 |
注意事項：
- 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
- 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
- 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
- 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n）。
- 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
- 底物請避光保存。
- 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
- 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
- 本試劑不同批號組分不得混用。
需要而未提供的試劑和器材：
- 37℃恒溫箱。
- 標準規(guī)格酶標儀。
- 精密移液器及一次性吸頭
- 蒸餾水，
- 一次性試管
- 吸水紙
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。。
操作程序
- 標準品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。)
16ng/ml | 5號標準品 | 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液 |
8 ng/ml | 4號標準品 | 150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
4 ng/ml | 3號標準品 | 150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
2ng/ml | 2號標準品 | 150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
1 ng/ml | 1號標準品 | 150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
- 根據(jù)代測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
- 將稀釋好的標準品按照濃度由高到低或者由低到高依次加入酶標包被板孔中。
- 分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品、生物素標記的抗Apoptosis抗體及鏈霉親和素-HRP，其余各步操作相同）及待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40μl，然后再加生物素標記的抗Apoptosis抗體10μl。加樣時將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
- 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
- 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。
- 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
- 加酶：每孔加入鏈霉親和素-HRP 50μl，空白孔除外。
- 溫育：操作同5。
- 洗滌：操作同7。
- 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
- 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
- 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進行。
實驗操作流程圖：
計 算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標 準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
