怎樣提高ELISA的敏感性—ELISA放大系統(tǒng)
為了提高ELISA的敏感性,在ELISA中人們采用不同的放大機(jī)制,建立在ELISA的幾類(lèi)放大系統(tǒng).現(xiàn)在向讀者介紹幾個(gè)比較重要的ELISA放大系統(tǒng).
一,生物-親和素系統(tǒng)(Biotin-Avidin System,簡(jiǎn)稱(chēng)BAS)
生物素與抗生物素之間具有*的親和力,可以縮短反應(yīng)時(shí)間,達(dá)到快速檢測(cè)的目的.另外,抗體和酶的生物素標(biāo)記率高,又不影響其活性,每個(gè)親和素分子能結(jié)合4個(gè)生物素,每個(gè)生物素能標(biāo)記大量酶分子,使得ELISA的敏感性大大提高,生物素與親和素的結(jié)合也極為穩(wěn)定,不會(huì)在洗滌過(guò)程中脫落.BA-ELISA是在常規(guī)ELISA的基礎(chǔ)上,結(jié)全生物素(Biotin)與親和素(Avidin)的高度放大作用,形成的一種檢測(cè)方法.BA-ELISA分為:
1,LAB法即酶聯(lián)親和素-生物素標(biāo)記法(Labeled avidin-biotin,簡(jiǎn)稱(chēng)LAB).用辣根過(guò)氧化物酶直接標(biāo)記親和素,用生物素標(biāo)記第二抗體.
2,ABC法即酶聯(lián)親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法(Avidin-Biotin-Peroxidase Complex,簡(jiǎn)稱(chēng)ABC).如用鏈霉親和素(Streptavidin),則形成鏈霉親和素-酶聯(lián)生物素復(fù)合物(Streptavidin-Biotin-Peroxidaes Complex,簡(jiǎn)稱(chēng)SABC).在ABC法中,用生物素標(biāo)記第二抗體,又用生物素標(biāo)記過(guò)氧化物酶.在使用前30min,親和素與酶聯(lián)生物素以1:1的比例混勻.1個(gè)親和素分子結(jié)合3個(gè)生物素分子,親和素剩下的1個(gè)結(jié)合點(diǎn)與標(biāo)記第二抗體的生物素結(jié)合,親和素起橋聯(lián)作用.ABC法比PAP(Peroxidase-antiperoxidase tech-nique)法敏感幾十倍.
3,BAB法即酶聯(lián)親和素-生物素橋法(Bridged avidin-biotin,簡(jiǎn)稱(chēng)BAB).用游離親和素(或鏈霉親和素)作為橋聯(lián)劑,將生物素標(biāo)記后開(kāi)成的復(fù)合物與酶標(biāo)記生物素連結(jié)起來(lái),然后進(jìn)行樣品的檢測(cè).由于標(biāo)記抗體分子上連有多個(gè)生物素,因此,終形成的抗原-生物素標(biāo)記抗體-親和素-酶標(biāo)生物素復(fù)合物可積聚大量的酶分子;加入相應(yīng)底物后,產(chǎn)生強(qiáng)烈的酶促反應(yīng),大幅度提高檢測(cè)的靈敏度.
二,堿性磷酸酶放大系統(tǒng)
堿性磷酸酶廣大系統(tǒng)包含多種放大機(jī)制:堿性磷酸酶不直接催化底物生成有色產(chǎn)物而是催化生成輔酶I(NAD+),輔酶I激活下一輪氧化還原反應(yīng),輔酶I啟動(dòng)的反應(yīng)為底物的顏色化學(xué)轉(zhuǎn)變提供條件.在供氫體的作用下,底物氧化/還原發(fā)生顏色變化.
三,微粒放大系統(tǒng)
每個(gè)適當(dāng)?shù)奈⒘１砻婵梢酝瑫r(shí)結(jié)合(或吸附)大量的標(biāo)記酶和抗體分子.在包含微粒放大系統(tǒng)的夾心ELISA法中,微粒通過(guò)結(jié)合于其上的第二抗體結(jié)合于抗體.同時(shí)微粒上又結(jié)合著標(biāo)記酶,其數(shù)量大大多于第二抗體能結(jié)合的標(biāo)記酶,從而得以放大.
四,催化的顯示劑沉積
催化的顯示劑沉積(Catalyzed reporter deposition,簡(jiǎn)稱(chēng)CARD).CARD依次使用三套顯示劑:套顯示劑是聯(lián)在抗體上的HRP,它通過(guò)抗體與待測(cè)抗原的反應(yīng)結(jié)合于固相表面;第二套顯示劑是標(biāo)有生物素的苯酚,它受到顯示劑的氧化催化后沉積于固相表面;第三套顯示劑是標(biāo)在鏈霉親和素(Streptavidin)上的AP,可被固相上的生物素捕獲,放大效果非常大.
