2018-01 版
呋喃西林代謝物 快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA 方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物呋喃西林代謝物將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃西林代謝物抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色， 樣本吸光值與其所含殘留物呋喃西林代謝物的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物呋喃西林代謝物的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度： 0.02ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min~15min
u 樣本檢測下限
組 織 ······································· 0.1ppb
雞 蛋 ······································· 0.1ppb
u 交叉反應率
呋喃西林代謝物 100%
呋喃唑酮代謝物 ＜0.1%
呋喃妥因代謝物 ＜0.1%
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
5 | 底物A 液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B 液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X 濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 2X 濃縮復溶液 | 50ml | 透明帽 |
10 | 衍生化試劑 | 10ml | 黑色帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋
微量移液器：單道 20~200µl、單道 100~1000µl、多道 30~300 µl
試 劑：氫氧化鈉、K2HPO4·3H2O、正己烷、乙酸乙酯、濃 HCl
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
（a） 實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b） 實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈， 必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
u 樣本前處理需配制
配液 1 0.1M K HPO 溶液：
2、 在 70℃水浴鍋中孵育 20min；
3、 分別加入 5ml 0.1M K2HPO4 溶液，0.4ml 1M NaOH 溶液和 6ml 乙酸乙酯，充分振蕩 30s；
4、 在室溫下（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min
（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ，在80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復離心；或提高轉速和延長離心時間重復離心）；
5、 取出 3ml 的乙酸乙酯到另一個容器中于 50℃氮氣/空氣吹干。
6、 用 2ml 正己烷溶解干燥物，再加入 1ml 樣本復溶液充分混合 30s；在室溫下 4000r/min 以上離心 10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min， 重復離心）；
7、 取 50µl 下層用于分析。
樣本稀釋倍數: 2 倍
此方法與呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、 呋喃妥因代謝物、氯霉素試劑盒可合一處理。
六、 酶標免疫分析程序:
u 測定前應須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫
（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。
3、 在ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定
個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標準品/樣品 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物 50µl/孔，然后再加入抗體工作液 50µl/ 孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應 30min。
6、 將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 顯色：加入底物A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色 15min。
8、 測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內讀數），測定每孔 OD 值。
七、結果判定
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方
法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含呋喃西林代謝物量成負相關。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3， 樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是： 0ppb 為 2.243；0.02ppb 為 1.816；0.06ppb 為 1.415；
0.18ppb 為 0.74；0.54ppb 為 0.313；1.62ppb 為 0.155。
2 4 程序中的要點。則樣本 1 的濃度范圍是 0.54ppb～1.62ppb；樣本 2
呋喃它酮代謝物 ＜0.1%
u 樣本回收率
組 織 95%±25%
雞 蛋 95%±25%
三、試劑盒組成
稱 11.4g K2HPO4·3H2O 加去離子水溶解定溶至 500ml。
配液 2 1M HCl 溶液：
取 8.6ml 濃HCl 加去離子水定容至 100ml。配液 3 1M NaOH 溶液：
稱 4g NaOH 加去離子水定容至 100ml
配液 4 樣本復溶液：
將 2X 濃縮復溶液用去離子水按 1：1 稀釋。
u 樣本處理
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟：
1、 從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～
25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于 2-8℃。
的濃度范圍是 0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中呋喃西林代謝物實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即
B
肌肉組織、雞蛋樣本處理方法
3、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去
離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份
百分吸光率（%）＝
×100%
B0
1、 稱取 1±0.05g 的均質物，分別加入 4ml 的蒸餾水，0.5ml 1M HCl 溶液和 100µl 衍生化試劑， 充分振蕩 2min；
去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃西林代謝物標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中， 從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中呋喃西林代謝物實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。
八、 注意事項
1、 室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～
25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
4、 反應終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質。
8、 該試劑盒最佳反應溫度為 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質期
1、 儲藏條件：試劑盒于 2～8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質 期：該產品有效期為 1 年，生產日期見包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
九、儲藏條件和保質期
1、 儲藏條件：試劑盒于 2～8℃保存，不要冷凍。
