禽流感病毒H5N1熒光PCR檢測試劑盒
禽流感病毒H5N1亞型核酸檢測試劑盒
（RT-PCR熒光探針法）
【產(chǎn)品概述】
本試劑盒針對AIV-H5N1高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含AIV-H5N1基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【試劑盒組成】
| 組成成份 | 包裝規(guī)格 |
| AIV-H5N1 PCR反應(yīng)液 | 875μl |
| AIV-H5N1混合酶液 | 125μl |
| 陰性對照 | 40μl |
| AIV-H5N1陽性對照 | 40μl |
【儲存條件及有效期】
-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個月。
【適用儀器】
ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。
【樣本采集、存放及運(yùn)輸】
u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；
u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（最多凍融3次）；
u 運(yùn)輸：采用冰壺或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
【自備試劑】
核酸提取試劑，如QIAGEN公司的 RNA核酸提取試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。
【使用方法】
注：所有試劑使用前需*解凍，混合均勻，6,000rpm離心數(shù)秒后使用。
1. 樣本處理（樣本處理區(qū)）
待檢樣本的核酸提取可采用病毒RNA提取試劑盒或自動化核酸提取儀等，具體提取方法請參照相關(guān)說明書；陽性對照及陰性對照無需提取，可直接使用。
2. 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（PCR前準(zhǔn)備區(qū)）
取N個（N=陰性對照+待檢樣本+陽性對照）PCR反應(yīng)管，每管分別加入PCR反應(yīng)液17.5 μl、混合酶液2.5 μl (也可根據(jù)每頭份用量計算N+1份PCR反應(yīng)液、混合酶液所需總量，兩者混勻離心后分裝20 μl至單個PCR反應(yīng)管)。
| 組分 | 每頭份用量 |
| AIV-H5N1 PCR反應(yīng)液 | 17.5 μl |
| AIV-H5N1混合酶液 | 2.5 μl |
將所有PCR反應(yīng)管于6,000rpm離心30s，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
在上述的PCR反應(yīng)管中分別加入待檢樣本RNA提取物、陰性對照和陽性對照各5 μl，蓋緊管蓋，于6,000rpm離心10s，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。
* 注意事項：建議加樣順序是陰性對照、待檢樣本、陽性對照。
4. PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增區(qū)）
1) 儀器設(shè)置（以ABI Prism 7500為例）
將PCR反應(yīng)管放入PCR儀內(nèi)，按照對應(yīng)順序設(shè)置陰性對照(NTC)、陽性對照(Standard)及待檢樣本(Unknown)。
FAM通道采集AIV-H5熒光信號，HEX通道采集AIV-N1熒光信號。Quencher Dye為None，參比染料(Passive Reference)為 None。
2) 擴(kuò)增程序
42℃ 10min
95℃ 3min
95℃ 5sec
55℃ 40sec
95℃ 5sec
55℃ 40sec
40Cycles中55℃采集熒光信號，反應(yīng)體系為25 μl。
【結(jié)果分析條件設(shè)定】
u 基線（Baseline）設(shè)定：應(yīng)選擇該次實驗指數(shù)擴(kuò)增前所有樣本熒光信號比較穩(wěn)定的一段區(qū)域（所有樣本熒光信號無較大波動），起始點(diǎn)（Start）應(yīng)避開熒光采集起始階段的信號波動，終止點(diǎn)（End）應(yīng)比最早出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增的樣本Ct值減少1~3個循環(huán)，建議基線設(shè)為3~15。
u 閾值(Threshold)設(shè)定：將閾值線設(shè)定在剛好超過正常陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。
【質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)】
1. 陰性對照的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性，Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期；
2. 陽性對照的檢測結(jié)果應(yīng)為陽性，有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35；
3. 以上要求需在一次實驗中同時滿足，否則該次實驗視為無效。
【結(jié)果判斷】
1. 陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35并有明顯指數(shù)增長期；
2. 可疑：有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期，且35＜Ct≤38，此時樣本為可疑樣本；對于可疑樣本建議復(fù)核一次，若復(fù)核結(jié)果Ct≤38且有指數(shù)擴(kuò)增期，則判定為陽性，否則判定為陰性；
3. 陰性：無指數(shù)擴(kuò)增期，Ct＞38或無Ct值均判定為陰性樣本。
【對檢驗結(jié)果的解釋】
| 通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 | |
| FAM | ||
| + | + | 標(biāo)本中檢出AIV-H5和AIV-N1。 |
| + | — | 標(biāo)本中檢出AIV-H5，未檢出AIV-N1。 |
| — | + | 標(biāo)本中檢出AIV-N1，未檢出AIV-H5。 |
| — | — | 標(biāo)本中未檢出AIV-H5和AIV-N1。 |
【試劑盒使用注意事項】
1. 有關(guān)實驗室管理規(guī)范請嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。
2. 本試劑盒僅用于體外檢測。
3. 實驗請嚴(yán)格分區(qū)操作：
第一區(qū)：PCR前準(zhǔn)備區(qū) — 準(zhǔn)備擴(kuò)增所需試劑；
第二區(qū)：樣本處理區(qū) — 待測樣本和對照品處理；
第三區(qū)：檢測區(qū) — PCR擴(kuò)增檢測。
4. 各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用，避免污染，實驗后即請清潔工作臺；
5. 試劑盒內(nèi)各試劑使用前，充分融化后請稍事離心。
6. 在－20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物，應(yīng)在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。
7. 分裝有反應(yīng)液的檢測管裝入密實袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本區(qū)。
8. 加樣時應(yīng)使樣品*落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快封上檢測管蓋。
9. 擴(kuò)增完畢立即取出檢測管，密封在專用塑料袋內(nèi)，丟棄于指D地點(diǎn)。
10. 反應(yīng)液分裝時應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。
11. 實驗中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi)，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
12. 工作臺及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒。
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