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免疫沉淀CHIP實(shí)驗(yàn)中要注意的事項(xiàng)有哪些？
點(diǎn)擊次數(shù)：1400 更新時(shí)間：2022-09-14
染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP）通過與染色質(zhì)片段共沉淀技術(shù)，在體內(nèi)檢測(cè)與特異蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA片段。ChIP技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)就是在活體細(xì)胞狀態(tài)下研究了蛋白質(zhì)和目的基因結(jié)合狀況，減少了體外實(shí)驗(yàn)的誤差。在活體細(xì)胞中，先對(duì)與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的染色質(zhì)進(jìn)行分離，然后隨機(jī)剪切染色質(zhì)，用調(diào)節(jié)蛋白的抗體沉淀目的染色質(zhì)，最后用QPCR、DNA測(cè)序的方法進(jìn)行檢測(cè)研究。
因?yàn)槊庖叱恋淼哪康闹饕峭ㄟ^抗體和目的蛋白相互作用從而捕獲目的蛋白，所以實(shí)驗(yàn)中要注意的關(guān)鍵點(diǎn)是抗體和目的蛋白相互作用的效果。其主要受抗體的結(jié)合能力，目的蛋白和抗體的可接觸性兩個(gè)因素影響。所以免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵因素是抗體的選擇以及裂解緩沖液中的配方。對(duì)于前者而言，抗體所針對(duì)的作用表位必須處于目的蛋白表面，對(duì)抗體結(jié)合力的要求和免疫印跡或者免疫熒光相比要高得多；對(duì)于后者而言，主要考慮因素是緩沖液中的去垢劑成分能否在不破壞目的蛋白天然構(gòu)像的情況下（不影響目的蛋白和抗體的相互作用效果）將目的蛋白從細(xì)胞局部定位（比如位于某些細(xì)胞器中）中有效釋放出來。
在所有免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，抗原的起始濃度相對(duì)其它免疫相關(guān)實(shí)驗(yàn)（WB和IF等）要低得多，所以對(duì)抗體的親和力相對(duì)其它實(shí)驗(yàn)提出了更高的要求，這就需要使用高親和力的抗體去進(jìn)行免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，由于免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)主要是在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，所以需要抗體識(shí)別蛋白的天然表面構(gòu)像，因此選擇的抗體其針對(duì)的抗原決定簇需要暴露在蛋白表面。
