CY3標記

CY3標記反應(yīng)原理：
Reactive CY3專一的與伯胺反應(yīng)（N-末端及賴氨酸殘基側(cè)鏈）形成穩(wěn)定的酰胺鍵

操作過程：
實驗前準備：

1.   仔細閱讀使用說明書。

2.   計算待使用Reactive CY3的量。

3.   提前20 min從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫（注：不需要用到的Reactive CY3繼續(xù)放置冰箱中）。

4.   溶解Reactive CY3：加入20 μL DMF至Reactive CY3瓶中，靜置10 min，待其充分溶解，此時CY3的濃度為10 mM。

 
操作步驟：（本操作步驟按照1 mg的量進行標記）

1.   取1 mg待標記抗體于Filtration tube中，并加入相應(yīng)體積的 Labeling Buffer至總體積為0.5 mL，12,000× g離心10 min。（注：①Filtration tube的最大體積為0.5 mL。②待標記抗體濃度低時，可先超濾離心一次。）

2.   加入13.3 μL Reactive CY3 和適量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使抗體的終濃度為2 mg/mL，并輕輕吹打混勻。放入37℃恒溫箱中避光溫育60 min。

3.   12,000 × g離心10 min。

4.   加入適量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使終體積為0.5 mL，并輕輕吹打混勻，12,000×g離心10 min。并重復(fù)操作一次。

5.   加0.2 mL Labeling Buffer至Filtration tube中，輕輕吹打。將濾芯倒轉(zhuǎn)放置于另一個離心管中，6,000×g離心10 min。

6.   收集離心管中的溶液，即為CY3標記的抗體。

 
注意事項：

1.   本試劑盒也可標記其它含有氨基（NH2-）的抗原、HRP、多肽，具體標記比例根據(jù)待標記物中氨基的數(shù)量確定。

2.   DMF要密封干燥保存，使用完立即用封口膜封緊。

3.   操作步驟5中，可用Labeling Buffer作為回收標記抗體的緩沖液，也可使用其它任何緩沖液或保護劑。

4.   本試劑盒未開封前的有效期為一年，請在有效期內(nèi)使用。

5.   本試劑盒提供的為10 kDa的Filtration tube，標記抗原或多肽請注意分子量的大小。

6.   在步驟2中，標記其它抗體時，我們應(yīng)先控制抗體的終濃度為2 mg/mL，然后再根據(jù)抗體的量計算應(yīng)加入Reactive CY3的體積。

7.   要確定在偶聯(lián)中不引入游離氨基（Tris，氨及疊氮鈉均可與活化CY3反應(yīng)，因此會降低蛋白與CY3的偶聯(lián)率）。

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