LDS1083豚鼠外周血單個核細胞分離液說明書
豚鼠外周血單個核細胞分離液說明書
【包裝規(guī)格】
200ml/瓶
【實驗前準備】
A．適用儀器
zui大離心力可達1200g的水平轉(zhuǎn)子離心機
B．耗材
|
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)地 |
15ml離心管散裝 | 339650 | 美國 NUNC |
15ml離心管架裝 | 339651 | 美國 NUNC |
50ml離心管散裝 | 339652 | 美國 NUNC |
50ml離心管架裝 | 339653 | 美國 NUNC |
無菌膠頭滴管或塑料滴管 |
|
|
【檢驗方法】
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在20±2℃的條件下進行。
首先根據(jù)樣本量大小，分以下幾種情況：
一、使用15ml離心管時：
情況A：血液樣本量小于 3ml時，實驗方法如下：
1.取一支15ml離心管，加入3ml分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件
需客戶自行摸索，以達到分離效果）。
3.離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個
核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
8. 250g，離心10min。
9.重復(fù)6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。
情況B：血液樣本量為3-6ml時，實驗方法如下：
1.取一支15ml離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件
需客戶自行摸索，以達到分離效果，但zui大離心力不超過1000g）。
3.離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個
核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
8. 250g，離心10min。
9.重復(fù)6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。
二、使用50ml離心管時：
情況A：血液樣本量為6-10ml時，實驗方法如下：
1.取一支50ml離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件
需客戶自行摸索，以達到分離效果，但zui大離心力不超過1200g）。
3.離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個
核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
8. 250g，離心10min。
9.重復(fù)6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。
情況B：血液樣本量為10-20ml時，實驗方法如下：
1.取一支50ml離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，650-110g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件
需客戶自行摸索，以達到分離效果，但zui大離心力不超過1200g）。
3.離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個
核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
8. 250g，離心10min。
9.重復(fù)6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。
【注意事項】
1.全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在20±2℃的條件下進行。為獲得的實驗結(jié)果，
在取血2h內(nèi)進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過6h
后分離效果更差甚至不能達到分離目的。
2.本實驗不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離
心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導(dǎo)致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面
會變成毛面，影響細胞分離效果。
3.吸取過多的單個核細胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的
粒細胞數(shù)量增加。
4.吸取過多的單個核細胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
5.如所實驗后細胞得率或活性過低，請上海研謹以尋求幫助，具體
詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
6.當血液樣本粘度過高需稀釋時，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：
2010C1119）1:1稀釋混勻備用。注：不當?shù)南♂尫椒〞档图毎寐始盎钚?。如血液?/span>
本經(jīng)過稀釋則分離過程中需適當降低離心力和離心時間。
【儲存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期2年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟
封后置常溫保存。如4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實驗淋巴細胞提取率及純度均大于80%。
下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例，用戶可適當進行參考。
【相關(guān)實驗技術(shù)方案】
1.所獲得淋巴細胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2.所獲得淋巴細胞的核酸提取技術(shù)。
3.所獲得淋巴細胞的鑒定方法
A.流式細胞技術(shù)
B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR技術(shù)
注：上述技術(shù)方案詳情請登陸上海研謹生物公司搜索細胞分離、
純化、擴增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊”，并在說明書項目欄下下載使用。
【可能存在的問題及解決方法】
1.由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短 | 適當增減轉(zhuǎn)速 |
離心后目的細胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長 | 適當增減轉(zhuǎn)速 |
離心后白環(huán)層彌散 | 細胞密度過大 | 調(diào)整細胞密度 |
離心后白環(huán)層太淺或看不 | 細胞密度過小 | 調(diào)整細胞密度 |
2.本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
區(qū)客戶可根據(jù)當?shù)厍闆r對離心條件進行適當調(diào)整。建議對離心條件進行調(diào)整時，恒定離
心時間，對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整。
3.本分離液依照標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可
能出現(xiàn)紅細胞沉降不*的情況，可以適當加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對離心條件進行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g為基數(shù)，直至達到分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min為準。
