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介紹免疫沉淀CHIP的實(shí)驗(yàn)步驟
更新時(shí)間：2020-12-28 點(diǎn)擊次數(shù)：3863次
免疫沉淀CHIP的原理是：在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過(guò)超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來(lái)。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化，以及DNA的鑒定。因?yàn)镃hIP實(shí)驗(yàn)涉及的步驟多，結(jié)果的重復(fù)性較低，所以對(duì)ChIP實(shí)驗(yàn)過(guò)程的每一步都應(yīng)設(shè)計(jì)相應(yīng)的對(duì)照，而且對(duì)結(jié)果的分析也需要有一定的經(jīng)驗(yàn)。對(duì)于剛剛開(kāi)始使用ChIP技術(shù)的研究人員來(lái)說(shuō)，使用成熟的商品化試劑盒和相關(guān)的技術(shù)服務(wù)會(huì)達(dá)到事半功倍的效果。
一、細(xì)胞固定
甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)是*可逆的，便于在后續(xù)步驟中對(duì)DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。值得注意的是，交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過(guò)程中丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)短，則交聯(lián)不*，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。
二、染色質(zhì)斷裂
交聯(lián)后的染色質(zhì)可被超聲波或MicrococcalNuclease切成400~600bp的片段（用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)），以便暴露目標(biāo)蛋白，利于抗體識(shí)別。超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時(shí)，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計(jì)時(shí)斷時(shí)續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫?？偝晻r(shí)間也不要太長(zhǎng)，以免蛋白降解。
